Около 20 грамм размороженного шпината растворяют в 25 мл этилового спирта. Хорошо перемешивают стеклянной палкой, чтобы разбить всю мякоть. Отделяют полученный раствор от мякоти с помощью обычной стеклянной воронки. В нижней части воронки должен быть комок ваты, который препятствует попаданию мякоти в отделяемый раствор. Мякоть высушивают с помощью сушильной бумаги. После высушивания, мякоть растворяют в 20 мл дихлорметана и хорошо перемешивают. Раствор отделяют в колбу объёмом 50 мл и испаряют в эвапораторе. В полученный продукт добавляют 10 капель петролейного эфира и 10 капель дихлорметана. Колбу необходимо полностью завернуть в алюминиевую бумагу, чтобы свет не разложил продукты.
2. Приготовление разделяющей колонны.
Всю работу следует делать в вытяжном шкафу! Низ колонны затыкают комком ваты и насыпают поверх чистый песок, около 0.5 см высотой. Песок используется как основание для будущей твердой фазы. В химический стакан объёмом 250 мл насыпают порошка оксида алюминия (Al2O3) высотой около 75 мл по шкале стакана и добавляют 40 мл петролейного эфира. Хорошо перемешав, переливают кашицу в колонну, стараясь чтоб не было пузырьков воздуха. Если не выходит перелить всю кашицу с первого раза, пропускайте жидкость через колонну в стакан с Al2O3 и, разбавляя, снова переливайте в колонну пока не получится твердая фаза высотой в 15 см. Сверху твёрдой фазу насыпают песок высотой в 0.5 см чтобы сохранять постоянную "влажность" твёрдой фазы.
3. Разделение продуктов.
С помощью стеклянной пипетки перемещают, подготовленный заранее раствор с продуктами. Кроме того, оставляют несколько капель для проверки тонкослойной хроматографии. Весь элюент (раствор) с образцами прошедший колонну собирают в отдельные пробирки. Первый элюент объёмом в 200 мл состоит из 95% объёма петролейного эфира и 5% объёма этил ацетата. Им промывают колонну до тех пор, пока не выходит весь оранжевый слой β - каротина. С 3-ей по 6-ую пробирку элюент был окрашен в слабо желтый цвет. Остатки β-каротина промывают элюентом в 50% объёма петролейного эфира и 50% объёма этил ацетата. Начиная, с 7-ой по 9-ую пробирки промывают колонну элюентом, состав которого 90% объёма этил ацетата и 10% объёма метилового спирта. Метанол лучше впитывается, чем этил ацетат, и таким образом вымывается зелёный слой хлорофилла. В конце колонну можно промыть чистым этил ацетатом, чтобы вымыть оставшийся хлорофилл. Собранные фракции с β-каротином и хлорофиллом переливают в отдельные колбы и испаряют в эвапораторе элюент.
4. Проверка тонкослойной хроматографии.
Вырезают прямоугольник из тонкослойной хроматографии величиной в 5Х2.5 см и обозначают карандашом на нем нижнюю и верхнюю границы. также обозначат три точки - неразделённый образец, отделённые образцы хлорофилла и β-каротина. Каждый образец добавляют с помощью отдельной капилляры. Готовят элюент состав, которого 80% объёма петролейного эфира и 20% объёма этил ацетата. Переливают в небольшой химический стакан высотой в 3 мм и кладут туда же тонкослойную хроматографию с образцами, прикрывая чашечкой Петри. Ждут, пока элюент поднимется до обозначенной верхней границы и вытаскивают, чтобы испарился впитавшийся раствор. После получения соответствующих различимых глазом точек рассчитывают Rf.
